灌流培养细胞生物反应器是一种通过连续补充新鲜培养基并同步移除含代谢废物的旧培养基，使细胞在稳定、优化的环境中长期高密度生长的培养系统。与传统的批式或补料分批培养不同，灌流培养可实现长达数月的连续运行，细胞密度可达10⁷-10⁹cells/mL，产物产量大幅提升。该技术已广泛应用于单克隆抗体、疫苗及CAR-T细胞等生物制品的生产。
一、设备组成
系统通常由以下核心部分组成：
1.生物反应器主体：通常为搅拌式生物反应器，用于悬浮培养细胞。此外还有中空纤维生物反应器、固定床/流化床反应器等形式。
2.细胞截留装置：最关键组件，负责将细胞保留在反应器内，允许不含细胞的培养液（上清）流出。主流技术包括：
-切向流过滤：细胞液通过蠕动泵形成连续环形流动，废液通过膜排出，细胞返回反应器。
-交替切向流过滤：用隔膜泵代替蠕动泵，通过往复吹吸实现培养基在截留单元中的往复流动。
-中空纤维膜过滤：通过半透膜截留细胞及大分子产物。
-其他方法：重力沉降、声学细胞截留、离心等。
3.培养基供给与收获模块：包括新鲜培养基储罐、废液收集罐及相应的泵送系统。
4.过程监测与控制模块：集成温度、pH、溶氧、罐压、流量等传感器及自动化控制系统。
二、工作原理
灌流培养的核心机制可概括为“一进一出，细胞截留”：
-连续补料：新鲜培养基持续泵入反应器，为细胞提供充足的碳源、氨基酸、生长因子等营养物质。
-同步收获与排废：含乳酸、氨等代谢废物的旧培养基以相同速率被移除，反应器工作体积保持恒定。
-细胞截留：细胞截留装置将细胞保留在反应器内，实现细胞密度持续提升而不需增大反应器体积。
-稳态维持：系统通过细胞放流（bleed）控制最大细胞密度，维持稳态活细胞密度。
关键运行参数包括：灌流速率（体积/天）、体积灌流速率（反应器体积/天）、细胞比灌流速率（每细胞每日获得的新鲜培养基量）。
三、设计方法
灌流培养反应器的设计聚焦于以下核心要素：
1.细胞截留策略选择：根据细胞类型、产物特性及规模需求选择适宜的截留技术。ATF因能缓解膜堵塞问题而应用广泛。
2.传质与混合优化：确保反应器具备出色的氧传质率，满足高密度细胞的耗氧需求。
3.自动化控制系统：设计全自动的气体、温度、pH、搅拌及灌流速率控制回路。
4.可放大性设计：支持从实验室规模到生产规模的线性放大。
5.N-1策略应用：利用灌流培养制备高密度种子细胞，缩短种子链和生产周期。
四、操作流程
1.系统准备：安装反应器、细胞截留装置及管路，进行在位灭菌。
2.接种与初始培养：接入种子细胞，以批式模式启动培养。
3.启动灌流：当细胞达到一定密度后，启动培养基连续供给与收获系统。
4.过程控制与监测：维持恒定的温度、pH、溶氧；根据细胞密度调整灌流速率和细胞放流速率。
5.产物持续收获：含目标产物的培养上清连续流出并被收集。
6.终止与清洗：达到预定运行周期后终止培养，执行原位清洗程序。
五、维护保养
1.防止污染：长周期运行对无菌要求极高。需定期检查所有管路连接和密封件。
2.膜组件维护：细胞截留装置的膜堵塞是主要风险。需监控跨膜压差，按需进行在线清洗或更换膜组件。
3.传感器校准：定期校准pH、溶氧、温度等关键传感器。
4.培养基管理：确保新鲜培养基储存无菌，避免污染。
5.系统验证：长周期培养需验证细胞表达产物的稳定性及各“亚批次”间的一致性。
6.设备巡检：定期检查泵、阀门、管路的运行状态，防止泄漏和堵塞。
